Entschlüsselung der Polymer‐Interaktionen in Biokonjugaten unterschiedlicher Architektur durch zeitaufgelöste limitierte Proteolyse mit massenspektrometrischer Analyse

Abstract Protein‐Polymer Konjugate erlauben eine pharmakokinetische Optimierung von therapeutischen Proteinen. Allerdings sind die Interaktionen des Polymer‐ und des Proteinteils des Biokonjugates oftmals unbekannt, so dass eine Optimierung des molekularen Designs weitestgehend auf empirische Beobachtungen beschränkt ist. Dieser Artikel schließt diese analytische Lücke durch Kombination einer limitierten Proteolyse mit massenspektrometrischer Analyse (LiP‐MS). Zur Bestätigung der LiP‐MS wurden zunächst Interaktionen des IFN‐α2a mit seinem Rezeptor (IFNAR2) bestimmt, die sich mit publizierten Strukturen des Komplexes deckten. Interaktionen konnten dann detailliert am Beispiel von Biokonjugaten des Interferon‐α2a (IFN) mit Poly(ethylenglykol) (PEG) und PEG alternativen Polymeren beschrieben werden. Dazu wurde ein IFN‐Biokonjugat zusammen mit einem „schweren“ 15 N‐IFN‐Wildtyp (IFN‐WT; interne Kontrolle) durch Trypsin verdaut und die Schnitterfolge am Biokonjugat mit denen am Wildtyp differentiell analysiert. Die Biokonjugate wurden mit 10 kDa PEG, linearem Poly(glycerol) (LPG) oder Poly(2‐oxazolin) (POX)über Cyclooctinlinker (BCN oder DBCO) ortsspezifisch mit Azid‐funktionalisiertem IFN‐α2a synthetisiert. LiP‐MS zeigte, dass die Interaktionsmuster der resultierenden Biokonjugate für PEG und LPG vergleichbar waren, nicht aber für POX, welches geringere Interaktionen mit dem Protein im Biokonjugat aufwies. Die mittels LiP‐MS gefundenen Wechselwirkungsprofile wurden durch atomistische Molekulardynamiksimulationen bestätigt und lassen kurzlebige Interaktionen des Polymerteils mit dem Proteinteil vermuten (<50 ns), zeigen aber auch die Abhängigkeit der Wechselwirkungen von dem verwendeten Polymer. Zusammengefasst gelingt es mittels zeitaufgelöster LiP‐MS‐Analyse, ein detailliertes Wechselwirkungsprofil des Polymerteils und des Proteinteils in Biokonjugaten zu kartieren. Die gut zu implementierende LiP‐MS Methode könnte dazu beitragen, die heute weitgehend noch empirischen Optimierungen von Biokonjugaten durch ein Hypothesen‐getriebenes Vorgehen zu ergänzen.